万金油：基因  载体 病毒  稳转 常见问题

1，如何选择适合我实验目的的病毒包装类型？

常用的病毒载体特点见表XXXX。其主要的应用范围比较见表七。研究人员需要依据自己具体的实验目的选择合适的病毒载体。锐赛的研究人员有丰富的病毒研究和使用经验，咨询锐赛的技术支持团队，您可以获取更多帮助。

2,  病毒可以高效感染任何靶细胞吗？

理论上，现有的病毒载体可以在任何条件下高效感染任何靶细胞。其依据是，病毒载体高效感染细胞主要受三个参数影响：

1)，细胞特性：分裂和非分裂细胞、体内所处环境有否存在血脑屏障阻碍。现有的病毒载体，综合起来，既可以侵染分裂细胞，也可以侵染非分裂细胞，而且还可以突破血脑屏障高效侵染脑神经细胞。

2)，细胞种类：不同组织细胞。虽然不同载体对不同组织细胞的侵染有倾向性，但通过改造病毒载体决定病毒表面糖蛋白的序列，即使针对同一类病毒，也可以获得最高达数百种不同侵染特性的载体系列，从而可以满足不同细胞类型的侵染需求。

3)，病毒载体的滴度。 除不同类病毒其滴度会不同外，病毒载体的滴度还受包装片段的特性影响，包括插入片段的毒性和大小。外源片段的毒性可以通过使用诱导调控系统或者改造病毒包装细胞系来减轻毒性影响，而插入片段的大小的影响可以通过选择对外源片段具不同容纳能力的病毒载体来避免。

锐赛拥有庞大的病毒载体库，可以最广程度地覆盖各种组织细胞，同时可以覆盖不同特性的细胞，还拥有各种诱导表达系统和经过改造的病毒包装细胞系可以包装具有细胞毒性的外源插入片段。

3,锐赛提供的这些病毒产品的安全性如何？

使用病毒载体的危险性主要有以下几个考虑因素：

1)，是否能重组产生致病性病毒; 2)，是否具备复制能力; 3)，是否能整合，并导致癌基因激活或者抑癌基因失活; 4)，免疫原性。

锐赛所使用的病毒载体，全部经过改造，去除了致病性元件和复制功能区，因此重组产生功能性病毒的概率极低。一部分病毒(腺病毒和腺相关病毒载体)，其整合几率低，因此安全性高。同时，针对部分具备整合能力的病毒载体(慢病毒载体)，还去除了其3’LTR内的激活元件，排除了其激活下游基因的能力。因此，这些病毒载体用于体外和动物实验，对使用者而言都具有极高的安全性。有的病毒载体，比如腺相关病毒载体，即使用于人体，也被认为是安全性非常高的一类基因治疗载体。尽管如此，我们建议，使用病毒载体进行细胞或动物实验时，需要遵循标准废弃病毒载体操作流程。

4,  如何选择合适的启动子用于体内动物实验？

部分质粒载体的启动子所含GC含量比较高，所以进入动物体内后，细胞会启动表观遗传学信号通路，对其进行甲基化修饰或者在染色体整合位点进行去乙酰化修饰从而抑制基因的表达。体外细胞的病毒载体转导偶尔发生类似修饰，但比较罕见。所以，针对体内动物实验，尤其是利用病毒载体制备转基因或者基因敲除、RNA干扰小鼠等，需要选择恰当的启动子才能表达外源插入片段。锐赛拥有丰富的经验，我们的启动子库可以帮助研究人员选择合适的启动子用于特定的实验。

5，什么时候需要使用诱导表达系统？

诱导表达系统无论是对于体外基因功能研究还是体内动物实验，都是非常有用的一套系统，当研究遇到以下情况时，建议使用诱导表达系统：

1)，所表达基因或者外源片段具有抑制细胞生长、引起细胞毒性等特性。

2)，需要在特定时间开启或关闭外源片段的表达。

6，成功构建诱导表达系统的关键是什么？

一个成功的诱导表达系统，需要达到以下效果：1)，对于诱导激活系统来说，需要在未激活前保持很低的表达水平，而激活后，能迅速地高水平并且稳定表达。2)，对于诱导关闭系统来说，需要在关闭前可以维持正常的表达水平，而添加诱导关闭物后，能迅速彻底地关闭基因的表达。

影响诱导表达系统构建成功的因素主要有以下几点：

1)，诱导表达载体自身调控元件：包括启动子的强弱、启动子对诱导物的响应效果、载体启动子外其它调控元件对插入片段表达的影响。解决方案包括使用组合诱导物以达到更佳效果，改造其它调控元件以减少泄露表达。

2)，稳定整合位点：由于构建诱导表达系统必须在稳定细胞株中实现，所以，稳定整合位点附近的转录活性对诱导表达系统影响很大。转录活性过低，导致诱导激活效果不佳，转录活性过高，导致诱导激活前表达水平过高或者诱导关闭后仍然有残留表达。因此需要构建多株稳定细胞株，并进行比较，挑取诱导前后均符合预期的一株进行实验。

3)，稳定整合后拷贝数：拷贝数过高也会导致诱导激活前表达水平过高或者诱导关闭后仍然有残留表达。所以建议使用逆转录(包括慢病毒)载体获得单拷贝细胞稳定株。

7，如何使用病毒液去感染靶细胞？

不同的重组病毒载体，不同的细胞，以及动物体内组织细胞请染，其具体的操作步骤都有所不同。所以建议研究人员依据具体的实验选择不同的操作步骤。 查阅锐赛的细胞侵染库，客户可以了解如何使用病毒载体液去感染靶细胞。如果您所要感染的细胞或组织不在G锐赛的细胞侵染库中，请咨询我们的技术支持团队获得进一步的帮助。

8,   重组病毒是怎么制备出来的？

参见：锐赛重组病毒制备流程

9，为什么常规转染方法筛选稳定株异常困难？

常规化学转染或者电转方法，其整合是非同源重组随机整合，几率非常低(10-8-10-6)  

，且这些转染条件下发生的整合多发生在转录非活跃区或者重复序列区，导致外源片段表达效率低，同时这些整合常常不稳定，随着传代次数的增加，即使在有压力选择的情况下也容易发生丢失。

10，为什么病毒载体介导的稳定株筛选方法效率要比常规方法高？

逆转录病毒载体的染色体整合依赖于病毒重组酶，是一个酶催化反应，因此效率相比随机整合要高多个数量级。而且整合位点多位于转录活跃区，因此表达效率高。同时其整合非常稳定，连续传代100代以上仍然保持稳定表达。

11,  如何选择适合的病毒包装类型进行稳定株筛选？

并非所有的病毒载体都适合用来进行稳定株筛选(表六)，首先需要挑选整合效率高，整合位点稳定的病毒载体。至今为止，逆转录病毒载体是最有效的可以介导基因整合的病毒载体。其次，依据具体实验要求，挑选不同整合位点倾向性的逆转录病毒载体。倾向于整合于转录起始位点附近的，容易造成下游基因的激活; 而整合于转录活跃基因内的，容易导致整合区基因的插入失活。

12,  病毒载体介导的稳定株筛选方法可以适用于任何靶细胞吗？

虽然普通的逆转录病毒载体可以用来进行稳定株的构建，然而这一类病毒载体并不能高效感染非分裂细胞，因此对于这一类分化细胞，可以使用慢病毒载体进行稳定株构建。也可以使用腺相关病毒载体高效感染非分裂细胞，这一类病毒载体虽然整合率低于慢病毒载体，但其可以以染色体外形式长期(数月至数年)存在于非分裂细胞中，因此可以避免进行稳定株筛选。

13,  锐赛提供的含有病毒载体元件的细胞稳定株的安全性如何？

这些病毒载体在整合入靶细胞后，缺少必要的病毒包装元件，产生功能性病毒的几率非常低，因此进行体外细胞实验或者动物实验时，很安全。不过，即使如此，对这些携带有病毒载体元件的细胞株处理也要按照标准废弃病毒载体操作流程执行。

14,  为什么稳定株构建服务中不使用腺病毒载体？

腺病毒载体由于其整合几率极低，被普遍认为是不具备整合能力的病毒载体，所以一般不用来进行稳定株构建。

15，稳定株是怎么筛选出来的？

稳定株筛选主要有三种筛选方法：

1)，单克隆环法：此类方法多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株的实验。其优点在于工作量小，只需将转染或者病毒载体感染后的细胞按照一定的细胞密度转移至新皿中，并使用合适的药物进行筛选，最后在克隆环的帮助下对单克隆细胞株进行挑选，并在新皿中完成扩增。缺点在于需要对细胞密度和药物浓度绘制致死曲线并选取合适的细胞密度和药物浓度进行筛选，一些细小的密度和浓度差别都会导致难以获取均一的单克隆，结果导致获取的克隆不纯，含有非整合的细胞。稳定整合的细胞在这样一类混合细胞中，很快会失去生长优势，最终导致失去稳定株。

2)，96孔单克隆稀释法：此类方法同样多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株以及筛选悬浮细胞稳定株的实验。其优点在于，理论上可以得到非常均一的单克隆，同时可以筛选悬浮细胞稳定株。其缺点在于，工作量比较大。

3)，逆转录病毒混合克隆制备法：此类方法适用于需要制备混合稳定株。优点在于可以在短时间内(1周)获得稳定细胞株，同时也可以随时将细胞稀释转移至新皿中获得单克隆细胞株。缺点在于需要制备逆转录病毒载体。锐赛的研究人员开发出快速制备病毒并获得稳定细胞株的技术，帮助科学家们迅速获得稳定株。

16,  单克隆稳定株和混合克隆稳定株有什么区别？我该选择哪一类用于我的实验？

单克隆稳定株顾名思义来源于含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增，而混合稳定株则由多个单克隆稳定株构成的克隆群，不同的单克隆其外源片段的整合位点不一样。

由于体外细胞多属于细胞系，其基因组呈现不稳定的特点，因此即使是同类细胞，不同细胞个体基因组背景都存在差异。当需要去除细胞群体干扰因素的时候，推荐使用单克隆稳定细胞株，其基因组背景相对单一，对实验结果干扰因素小。当进行系统生物学研究时，多考虑这类因素。同时也是由于不同细胞个体差异大，而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞行为可能不一致，所以许多实验使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰。

混合稳定株可以通过逆转录病毒直接筛选获得，或者通过将众多不同的单克隆稳定株混合获得。前者无论是是从质量，还是时间周期来看都更好。

17,  怎么判别筛选的稳定株是单克隆？

1)，如果外源片段含有荧光标记，可以直接使用流式细胞仪检测其荧光是否均一; 如果还有其它标签，可以进行免疫荧光标记，再使用流式细胞仪观察荧光分布是否出现均一峰值。因为不同单克隆由于整合位点不一样，其表达强度也会受附近染色体结构的影响，出现差异。

2)，如果外源片段不含任何标签或者荧光标记，则可以使用分子生物学比如Southern Blot的方法鉴定。

3)，使用96孔板稀释法筛选，得到的阳性克隆一般是单克隆。因为最初如果混有非整合细胞，则含有整合外源片段的单细胞多半会失去生长优势，无法得到阳性克隆。使用单克隆环法，如果挑取的是致密，单一的克隆，那么多半也是单克隆。

18，如何判别筛选的稳定株是100%含有外源整合片段的细胞群？

通过观察所携带的荧光标记或者对外源插入片段进行免疫荧光标记可以判断稳定株是否混有非整合细胞。

19，如何选择适合我实验目的的RNAi病毒载体包装类型？

参见：如何选择适合我实验目的的病毒包装类型？

对于RNAi病毒载体而言，更大的差异在于质粒载体的设计，病毒载体的选择遵循一般的实验选择要求。需要注意的一点可能是，最好使用可以稳定整合或者长期稳定表达的病毒载体，因为对于部分基因而言，RNA干扰效应需要长时间表达RNA干扰片段后才能发挥作用。更多详细内容，参见：为什么有的时候构建RNAi稳定株对达到高效的基因干扰效果是必须的？

20，为什么有的时候构建RNAi稳定株对达到高效的基因干扰效果是必须的？

RNA干扰效应主要是影响目的基因所表达的mRNA的稳定性或者翻译，并不影响已经存在的目的蛋白的状态。部分蛋白其稳定性异常高，即使mRNA的表达水平或者翻译受到干扰，目的蛋白仍然可以在很长一段时间内发挥功能。因此需要进行稳定株筛选，以挑取干扰效果好的细胞克隆进行实验。在一些极端情况下，甚至需要进行第2轮稳定株筛选，才能获得一个比较好的RNA Knock down细胞株。

21，如何选择适合我实验目的的microRNA病毒载体包装类型？

参见：如何选择适合我实验目的的病毒包装类型？

对于microRNA病毒载体而言，与RNAi病毒载体类似，更大的差异在于质粒载体的设计，病毒载体的选择遵循一般的实验选择要求。

22，什么是shRNAmir载体？ 锐赛用的miR30-shRNA第二代载体是怎么设计的？

miRNA首先以长链初始miRNA(pri-miRNAs)的方式被转录出来，然后被Drosha复合物识别并剪切成70-90 nt长度的前体miRNA(pre-miRNAs)。由于miRNA也是通过RNAi通路发挥抑制基因表达的功能，因此普遍认为，如果要使用载体在细胞中高效表达外源RNA干扰片段而不是合成siRNA片段，那么通过模拟体内产生miRNA的方式来表达外源RNA干扰片段，会使得整个外源RNA干扰片段的转录成熟加工过程效率更高，因为这种载体设计充分利用了体内的miRNA转录以及成熟加工机器。

锐赛使用miR30-shRNA第二代载体进行RNA干扰实验。目的干扰序列片段两端是的人miRNA，miR30，的初始转录序列miR30-5’和miR30-3’。因此shRNAmir30载体转录出来的是一个含有人miR30部分序列和外源RNA干扰片段的嵌合体。这种嵌合体能有效模拟细胞内天然pri-miR30的剪切加工成熟过程。启动子可以是聚合酶II型或者III型，前者用于构建稳定株时其在不同细胞间表达差异会更小。

第一代shRNA载体主要是模拟已经被Drosha复合物剪切后的前体miRNA的结构，其两端并无初始miRNA的序列。而第二代shRNAmir载体模拟的是初始miRNA的转录长链，其两端序列可以被Drosha复合物识别并剪切。第二代shRNAmir载体由于更

23，第一代shRNA载体和第二代shRNAmir载体有什么区别？为什么锐赛使用miR30-shRNA第二代载体进行RNA干扰实验？

天然地模拟了体内miRNA的转录加工过程，因此其被招募到RISC复合物的效率更高，其最终产生成熟shRNA的效率要比第一代shRNA载体高12倍。因此锐赛使用miR30-shRNA第二代载体所表达的外源RNA干扰片段，可以更多地被招募到RISC复合物中，并获得更高的抑制效率。

24，为什么同一个RNA干扰片段在不同的细胞中沉默基因表达的效率会有差异？

不同种类细胞间，RNA干扰片段的基因沉默效果由许多因素决定：

1)，干扰片段所对应的目的mRNA的位点特性：是否有蛋白结合导致干扰片段无法接近目的序列，不同细胞其结合蛋白的多少可能不一样从而影响沉默效果;

2)，目的mRNA的表达量：不同细胞种类间含量不一样，可能导致沉默效果会有差异;

3)，RNAi加工处理复合物的表达量：比如Dicer、Drosha以及运输RNAi加工中间体出核或者入核的蛋白(比如Exportin-5)和RISC复合物等。不同细胞，以及不同的病理和生理情况下，许多蛋白的表达量都有明显差异，这也是导致同一个干扰片段在不同细胞间会产生不同的沉默效果的重要因素。

4)，同一种shRNA载体在不同细胞中，其启动子活性可能不同，导致其表达量会有差异，从而最终影响基因沉默效果。

5)，如果是用化学合成的siRNA，不同细胞核酸酶的活性高低也会影响siRNA的代谢速度，导致沉默效果出现差异。

25，为什么第二代shRNAmir30载体比化学合成的siRNA更适合用来沉默基因表达？

参见为什么是shRNA?

26，锐赛使用什么样的系统来评价RNA干扰效果？

由于不同类细胞之间差异甚大，所以一个RNA干扰片段在某些细胞中作用效果很好，但在另外一类细胞中可能效果不好。研究人员需要寻找具体原因，并采取对应的措施去解决。基于此，锐赛采用过表达干扰评价系统：在少数几类细胞中，通过过表达目的基因和shRNA载体，在mRNA或者蛋白水平上检测外源目的基因的被沉默效果。这样一套系统可以确保得到具备沉默能力的shRNA载体。

27， 为什么锐赛的RNA干扰评价系统在mRNA或者蛋白水平上检测外源目的基因的被沉默效果，而不是同时保证在mRNA和蛋白水平上的被沉默？

RNA干扰的最终目的是为了通过抑制mRNA的表达从而降低目的蛋白的表达水平。其主要原理是当目的mRNA的表达受到抑制时，蛋白合成减少，所以随着已存在的目的蛋白的自然代谢降解，最终目的蛋白的含量也会随之降低。所以最终蛋白水平的变化受mRNA的干扰效果和目的蛋白的稳定性两个方面综合影响。

1)，mRNA水平的检测：细胞内部分蛋白因为稳定性极高，所以即使mRNA的表达受到很大程度的抑制(比如70%以上的目的mRNA被降解)，目的蛋白的含量仍然可以维持很长一段时间保持不变或者降低很少。所以当在mRNA水平检测到严重的降解，说明RNA干扰系统已经发挥作用，但由于目的蛋白的特性，使得其已合成的蛋白还可以维持很长时间。有几种方法可以解决这个困境：1)，使用可以长期感染靶细胞的病毒载体，延长RNA干扰时间; 2)， 构建细胞稳定表达株。

2)，蛋白水平的检测：由于shRNA载体相比化学合成的siRNA有更多的优势，因此锐赛采用第二代shRNAmir30载体表达外源RNA干扰片段，抑制基因的表达。虽然shRNA的主要作用机制是降解目的mRNA，然而大量数据表明，和miRNA类似的是，shRNA常可以在不影响目的mRNA的表达水平情况下，通过抑制翻译来影响目的蛋白的表达。因此，出现目的蛋白的表达水平下调，而mRNA的表达水平并无变化的情况并无意外。这种情况下，针对蛋白水平进行检测，也可以反应RNA干扰系统已经发挥作用。

因此，锐赛提供mRNA或者蛋白水平上的变化，研究人员需要依据具体情况采取下一步策略。