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酶联免疫吸附测定

ELISA

实验原理

酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。基本原理是：1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化频率很高，故可放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据反应后颜色的深浅进行定性或定量分析（见图4.7）。

图4.7 ELISA检测原理示意图

实验流程

实验结果展示

Conecntrations

图4.8ELISA标准曲线

表4.1五组样本目的蛋白ELISA吸光度值及浓度

TROUBLESHOOTING

常见问题FAQ

Q：ELISA 试 剂 盒 主 要 有 哪 些 试 剂 ？

A：ELISA 试剂盒中主要有

1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；

3）酶的底物；

4）标准品；

5）结合物及标本的稀释液；

6）洗涤液；

7）酶反应终止液。

Q：造成ELISA实验结果不正常的因素有哪些？

A：造成ELISA测定结果不正常的因素主要有：

1）标本因素：样本需新鲜采集，防止污染，且准确稀释至适当的倍数。

2）试剂因素：ELISA试剂盒在保质期内，其他试剂如蒸馏水的水质等。

3）操作因素：注意操作细节，如加样不可太快，避免加在孔壁上；洗板过程中注意洗液不能溢出孔外；显色要注意控制时间等。

Q：如何准备需要进行ELISA检测的细胞样本？

A：检测细胞分泌性成份时：用无菌管收集细胞培养上清，离心20分钟（2000-3000转/ 分）

取上清检测。检测细胞内成份时：收集细胞，用PBS（pH7.2-7.4）稀释细胞浓度至 106/ml左右，通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟（2000-3000 转 / 分），收集上清。保存过程中如有沉淀形成，需再次离心。

Q：ELISA 试剂盒（96 孔规格）一般可以进行多少个样本的检测？

A：标准品孔和待测样本孔需进行复孔操作以保证数据的可信度。每次需将标准品按照7-8个梯度稀释以制备准确的标准曲线。一次96孔板实验可以进行20-25个样本的检测工作。

Q：ELISA 的检测数据如何进行处理？

A：1）将得到的各个复孔浓度的吸光度值计算平均值。

2）按照横坐标为梯度稀释的标准品浓度，纵坐标为吸光度值做散点图，添加趋势线，利用多项式回归分析计算由以上数据产生的公式与 R2 值（R2 值越接近1说明线性关系越好）。

3）根据公式及待测样本的平均吸光度值计算样本中目的蛋白的浓度。

Q：常用的免疫学检测方法ELISA和WB的区分有哪些？

参考文献

1. J.R. Crowther. The ELISA Guidebook. Hunana Preaa,2001.

2. J.R. Crowther. ELISA:Theory and Practice.Humana Press,1995.