实验原理
细胞培养是采用无菌操作的方法，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，
从而观察细胞的增殖、分化以及细胞衰老等过程的生命现象。常见的细胞培养方式可分为贴壁和悬浮两种。细
胞培养的常规操作包括：1）细胞的接种和传代；2）细胞计数；3）细胞的复苏和冻存。常见的细胞培养类型见图7.1。
图7.1常见的细胞培养类型
A ：三种常见的细胞形态；
B ：有限传代细胞系和无限传代细胞系
技术应用
细胞培养至最佳状态后可进行各种处理，如1）加药处理；2）质粒转染；3）病毒感染；4）培养条件的改变等，进而对细胞功能进行各项检测，并对细胞信号通路蛋白进行表达分析及功能研究。
实验流程
| 实物 | 数据信息 | 实验周期 |
客户提供 | 细胞株（冻存株或培养细胞） | 细胞培养信息 | 2周 |
我们提供 | 后续实验所需数量的细胞 | 基本实验步骤、细胞培养照片 |
实验结果展示
图7.2 原代细胞培养成功案例
TROUBLESHOOTING
实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 |
细胞复苏失败？ | 冻存操作 | 细胞冻存过程要求降温缓慢，冻存细胞密度不能多低，操作过程动作要轻柔，冻存液配制后不能存放太久。 |
复苏操作 | 细胞复苏要注意快速融化，操作过程动作要轻柔，接种前采用预热的培养基缓慢稀释。 |
在培养细胞死亡？ | 培养箱条件发生变化 | 检查培养箱温度CO2浓度是否发生很大波动。 |
培养基发生变态 | 有毒代谢产物堆积对细胞毒性较大。 |
细胞生长速度变慢？ | 细胞传代次数过多 | 对于无线传代细胞建议采用代数较低的细胞。 |
培养基和血清 | 采用该细胞推荐及质量更好的培养基和血清；补加L-glutamine或必需生长因子 |
细胞接种密度过低 | 提高细胞接种密度。 |
支原体污染 | 丢弃污染的细胞株，更换新的细胞株及培养基。 |
常见问题FAQ
Q:细胞的运送有哪些注意事项?
A ：通常分为细胞冻存株和培养细胞两种运送方式，
注意事项如下:
细胞冻存株运送:将冻存的细胞株放在盛有液氮或干,冰的特殊容器中保存运送,不宜长时间运输。注意装有液氯的保温瓶不要拧紧,以防止瓶内气压过大无法开启甚至引起爆炸。
培养细胞运送:一般选择生长良好的细胞,铺板密度以40%-60%为宜,去掉原培养液,补充新培养液至瓶颈部,保留微量空气(注意:若空气留量过多,运输时大气泡来回流动对细胞状态有影响),拧紧瓶盖,并用胶带密封,放在用棉花等做防震防压处理的, 运送盒内。一般快递周期3天内可保证细胞状态没有, 问题,注意冬天气温过低无法采用此方法快递。
Q ：关于提供的细胞需提供哪些培养信息?
A :请告知细胞的具体名称及来源、培养基类型及血清浓度、培养温度及Co浓度、细胞增殖时间、传代方式,我们会根据以上信息对细胞进行培养、扩增和冻存工作。
Q :原代细胞的分离培养相对常规细胞系的培养有哪些注意要点?
A :凡是来源于胚胎、组织器官及外周血,经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞的培养有其难度,区别于常规细胞系注意要点如下：
1) 细胞的取材来源:取材应注意组织类型、分化程度、年龄等,一般来讲,胚胎组织较成熟个体组织容易培养,分化低的较分化高的组织容易生长,肿瘤组织较正常组织容易培养。
2) 取材应严格无菌:确保所取材料及器皿手术器材无菌并在无菌条件下操作。
3) 防止邻近组织细胞的污染:分离时要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织,可根据客户要求进行细胞的免疫化学检测。
4) )组胞量少且状态难以调整:受到取材困难等因素的影响,获得的细胞量少,细胞状态不佳造成的细胞增殖缓慢往往造成实验室人员长时间进行细胞状态调整,无法获得足量的细胞进行后城检测实。
Q ：:常见的细胞培养基有哪些?
培养基类型 | 特点 |
RPMI-1640 | 专为淋巴细胞培养而设计的，广泛应用于悬浮细胞的培养及肿瘤细胞的培养。 |
MEM | 由Eagle’基础培养基发展而来的，增加了组分的范围及浓度。 |
DMEM | 在MEM的基础上将氨基酸等成分浓度加倍，分低糖型和高糖型，后者更适于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞。 |
αMEM | 含有附加的氨基酸、维生素以及核苷2和脂肪酸，它可广泛应用于各种细胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 |
F12 | 培养基成分复杂，含多种微量元素，可与DMEM以1：1混合使用。 |
McCoy’ s5A | 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种原代移植物（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的生长，除一般的原代细胞培养，还主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞的培养以及难培养细胞的生长支持。 |
无血清培养基 | 由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 |
Q :常见的绸胞污染类型有哪些?
A :常见的细胞污染类型有细菌,真菌,支原体,病毒,酵母污染。如果客户接收到的细胸在培养过程中遇到细胞污染,请尽快提供细胞污染的照片,并且详细告知污染产生的时间,是否为个别孔污染等详细信息,以便于我们分析确认,在最短的时间内为您解决污染问题。
Q :为什么培养的细胞要及时传代?而哪些细胞则不再发生增值？
A :体外培养的细胞大多具有生长接触却制的特性, 也就是说当一个细胞被其他绸胞包围的时候,它就会停止生长,及时传代后,细胞的生长得以继续。因此客户需详细告知我们细胞的消化时间,传代比例,增殖时间等重要的信息。对于高度分化的细胞如红细胞,神经细胞己丧失了分裂能力不再进行增值，如果细胞量提供有限的话,要根据实验求计划好所需的组胞量,以防止后续实验无法顺利进行。
参考文献
1. R.Ian Freshney. Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications[M].Wiley-Blackwell Press,2011.
2. David L.Spector,Robert D. Goldman, Leslie A. Leinwand. Cells: a laboratory manual[M]. Cold Spring HarborLabrotary Press,1998.
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