实验原理
细胞迁移是指细胞在接收到内源或外源迁移信号后而产生的移动。细胞迁移是通过胞体形变进行的缓慢的定向移动，涉及细胞觅食、伤口痊愈、胚胎发生、免疫反应、感染和癌症转移等生理现象。因此通过对细胞迁移的研究，对阻止癌症转移、异体植皮等医学应用方面具有一定意义。细胞侵袭实验则是研究肿瘤细胞对基质膜消化后的迁移运动，肿瘤细胞须经血管基底膜穿入深面间质后才能侵袭组织和转移至远处。
肿瘤细胞侵袭迁移能力的改变通常采用Transwell小室进行检测。Transwell小室是一种膜滤器,也可认为是一种有通透性的支架( Permeable Supports )。这层膜带有微孔,孔径大小0.1-12.0um,根据不同需要可用不同材料,一般常用的是聚碳酸酯膜。将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
技术应用
应用包括细胞迁移,趋化(趋化因子对细胞的定向诱导),侵袭(癌细胞侵袭是指肿瘤细胞向局部侵犯或远处转移),共培养(同一培养体系里,两种细胞非接触性培养)。细胞迁移侵袭是涉及多个步骤、高度完整的过程,在癌症转移、动脉粥样硬化和关节炎等疾病恶化中起重要作用。
实验流程
| 实物 | 数据信息 | 实验周期 |
| 客户提供 | 细胞株（冻存株或培养细胞） 及所需药品 | 细胞培养信息和药物处理 | 4周 |
| 我们提供 | 剩余药物 | 基本实验步骤、细胞培养照片、结晶紫染色照片。 |
实验结果展示
图1 Transwell细胞迁移实验结晶紫染色结果及柱形图分析
TROUBLESHOOTING
实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 |
细胞聚集在小室中央？ | 细胞接种 | 接种前将小室浸润并注意细胞接种操作。 |
小室重复使用多次 | 采用未使用过的Transwell小室。 |
细胞侵袭结晶紫染色镜 下观察明显不均匀？ | Matrigel胶未铺匀 | 冰上配制Matrige胶，注意将枪头及小室预冷。 |
阳性细胞迁移失败？ | 细胞接种密度不当 | 预实验摸索细胞接种密度，不能过高或过低。 |
Matrige胶铺制过厚 | 降低Matrigr胶的厚度 |
过移时间过短 | 适当延长迁移观察时间。 |
常见问题 FAQ
Q : Transwell趋化性实验是怎样操作的?
A :上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。1)细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。2)趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
Q :侵袭实验小室上铺制Matrigel胶有什么作用?铺制Matrigel胶有哪些注意事项?
A :我们在Transwell小室的膜上涂上一层基质胶Matrigel ( BD公司产品),模仿上皮细胞和内皮细胞下面的一层较薄的细胞外基质,肿瘙细胞需分泌基质金属蛋白酶( MMPs)来降解Matrigel胶将基质消化后才可以从上展转移至下层,我们检测小室底部的细胞量就可以知道细胞的侵袭能力。由于Matrigel胶的浓度和厚度以及下腔的趋化因子强度是Transwell实验成功的基本条件。如果Matrigel胶浓度太大或者涂得太厚,则不容易评价肿瘤细胞的侵袭作用。因此,一般要对Matrigel胶做一定比例的稀释,具体浓度应当考虑所用的肿瘤细胞分泌的MMPs的情况和下腔设置的趋化因子的情况后确定。
Q :细胞划痕实验怎样操作?和Transwell移实验比较的优缺点?
A :划痕实验待长满细胞并形成单层后开始划痕操作:用10ul枪头沿培养板底部呈“一”字形划痕;观察划痕区域并进行拍照,记录初始划痕区相对距离后将培养板放回CO2培养箱内进行培养,然后0-30h内每6h观察一次划痕的距离并拍照,以记录划痕区距离(注意每次观察区域要相同)。通过拍照获得的细胞照片相对Transwell有比较直观的实验结果,即可观察到细胞划痕是否聚合,但无法如Transwell迁移实验通过细胞吸光度数值进行定量和统计分析。
Q : Transwell侵袭迁移实验对穿过细胞进行结晶紫染色后的检测方法有哪些?
A :结晶紫染色液配制简单方便,穿过细胞采用结晶紫染色后有两种检测方法:直接镜下计数或者OD值间接检测。后者主要用于穿过细胞过多以至于成堆,难以进行准确计数的情况,可以将结晶紫洗脱液在酶标仪570nm测其OD值,间接反映细胞数。
Q :使用Transwell小室进行不同实验所需的孔径有何要求?
A :不同的Transwell实验要求需要选择合适的孔径,共培养要求上室细胞不能穿过聚碳酸酯膜进入下室，一般采用0.4um共培养;进行迁移以及趋化性实验(上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室),我们建议采用的是8um或12um孔径。
Q:各种细胞都可以进行Transwell侵袭实验吗?
A:有侵袭能力的细胞才可进行Transwell侵袭实验。建议实验前进行qPCR预实验检测MMPs的表达,特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况,就盲目进行Transwell侵袭实验,有可能会获得阴性实验结果。
参考文献
1 Alini A. Iwatoto Y, Kieinman HK，et al A rapid inVitro assay fot quantitating the invasive potential of tumor cells.Cancet Res 1987,47(12): 3239- 3245.
2 Repesh LA. A new in vitro assay for quantitating tumuor. cell invasion Invasion Metastasis 1989,9(3):192-208.
3 Fong CJ. Sutkowskt DM, Kozlowski JM,et al. Utilization of the Boyden chamber to further characterizes in vitromigration and invasion of benign and malignant human prostatic epithelial cells. Lnvasion Metastasis 1992, 12(5-6):264-74.
沪公网安备 31011502005995