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实验原理

CCK-8（Cell Counting kit-8）试剂中含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan），生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，可采用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，间接反映活细胞数量。

技术应用

该方法已被广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增值实验（1-6天）、细胞毒性实验、药物敏感度实验、细胞基质黏附实验等。

实验流程

实验结果展示

图1 CCK-8法检测待测细胞靶基因经RNA干扰后1-6天的增殖情况

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常见问题FAQ

Q : CCK-8试剂盒检测细胞增殖和毒性的优点有哪些?

A : A: CCK-8较传统的MTT法优点在于1) MTT被线粒体内的一些脱氢还原酶还原成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解,而CCK-8产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤; 2) CCK-8检测灵敏度更高,更加稳定; 3)酚红和血清对其测定无明显影响; 4)不必去上清,不必洗, 涤细胞,更加简便; 5)对细胞无明显毒性,加入显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,而且不影响细胞进行后续实验。

Q :在做细胞的加药实验时,药物对CCK-8测定是否有影响?如何解决?

A : 1)注意如果药物具有还原性(如维生素C),会和CCK-8发生显色反应,增加吸光度。2)药物中的金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1mM的氯化亚铅、氧化铁、硫酸铜会抑制5%,15%, 90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK-8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。3) 由于培养基中可能含有氧化还原反应的物质,在正式实验之前,建议使用一个孔作一下检测,有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常的0D值应该在0.4以下。

Q : CCK-8如何设定空白对照?

A :在不含细胞的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度作为空白对照。

Q : CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样?

A :不一样,悬浮细胞较贴壁细胞难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

Q :可否采用CCK-8法进行肿瘤细胞的基质黏附实验?

A :可以,以层粘连蛋白(Ln)包被96孔板,通过计算不同时间点孔板中贴壁细胞的数量反映细胞的黏附性。细胞的黏附性越强,则单位时间内贴于铺有Ln板底的细胞数量越多,去除尚未贴壁的细胞后,应用CCK-8等方法计量细胞数量便可间接反映不同细胞或不同处理的细胞黏附能力的差异。

Q :可否采用CCK-8法进行药物的IC50检测?

A :可以,将细胞培养后按照不同浓度的药物处理-定时间后进行CCK-8检测,根据吸光度绘制曲线,计算该药物抑制细胞数量一半时的浓度(IC50)。

参考文献

1. Ishiyama M, Miyazono Y, Sasamoto K, et al. A highly water-soluble disulfonated tetrazolium salt as a chromogenicindicator for NADH as well as cell viability. Talanta 1997,44(7): 1299-1305.

2. Ishiyama M, Tominaga H, Shiga M, et al. A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicity with a highlywater-soluble tetrazolium salt, neutral red and crystal violet.Biol Pharm Bull 1996,19(11):1518-1520.