实验原理
细胞凋亡(Cell apoptosis)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下的损伤，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞凋亡检测的方法很多，我们采用的Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的原理：磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行EGFP融合、荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针。(如下图7.4所示）。
图7.4 Annexinv检测细胞凋亡的原理
碘化丙啶(Propidine lodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但可进入凋亡中晚期的细胞和死细胞，而使细胞核红染。Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡，可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期以及死细胞区分开。
技术应用
细胞凋亡研究不仅受到基础医学界的重视,也日益受到临床医学领域的青睐。通过检测药物、基因或蛋白对细胞凋亡及凋亡调控基因的影响,在肿瘤防治、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都发挥着积极的作用。
实验流程
| 实物 | 数据信息 | 实验周期 |
| 客户提供 | 细胞株（冻存株或培养细胞） 及所需药品 | 细胞培养信息和药物处理方式 | 3周 |
| 我们提供 | 剩余药物 | 基本实验步骤、细胞培养照片、 流式上机图片、数据分析结果 |
实验结果展示
图1 采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡
TROUBLESHOOTING
实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 |
空白细胞凋亡率高？ | 操作不当 | 操作动作轻柔，收完样后尽快上机。 |
检测试剂量过大，信号过强 | 降低试剂用量。 |
采用Annexin V/PI双染 法检测凋亡诱导后的阳 性对照样本凋亡率偏低？ | 试剂盒过期 | 4℃保存时间不要超过半年。 |
荧光淬灭 | 操作过程中注意避光，加完染料之后最后在2h内检测。 |
丢弃细胞培养上清 | 细胞培养上清中含有漂浮细胞，丢弃后造成凋亡比例偏低。 |
常见问题FAQ
Q :常用的细胞凋亡的检测种类有哪些?
A :凋亡检测方法有数十种之多,主要可以分为以下几大类: 1) DNA水平,检测凋亡时基因组DNA的变化; 2)蛋白水平,主要检测凋亡时线粒体和死亡受体两大凋亡通路的变化; 3)细胞膜/细胞器膜水平,主要检测凋亡时细胞膜成分或者膜电位的变化; 4)超微结构,主要检测凋亡时亚细胞结构的变化。这些方法各有优缺点,必须结合具体的实验目的,实验条件以及实验处理来选择合适的分析手段。
Q :常见的细胞凋亡检测方法及优缺点比较?
方法 | 优点 | 缺点 |
Anexin VPI双染法: Annexin v可结合凋亡细胞外翻的PS 蛋白。 | 可以准确的进行凋亡细胞的计数。 | 反应完毕后需在一小时内检测，贴壁细胞吹打处理要轻柔，防止机械损伤对实验结果的影响。不能用于组织样本。 |
Sub G1 峰检测： 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计划分析，分析DBA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。 | 适用性广，操作方便。 | 对实验操作及实验结果的分析能力要求较高。不能用于组织样本。 |
TUNRL法： 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产 生大量的粘性3‘ -OH末端，可在脱氧 核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用 下，对DNA的3’ 末端进行荧光剂标记。 | 原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，特别适用于组织样本的凋亡研究。 | 操作要求高，组织样本需要固定，固定方式不好可能导致背景高、信号弱。 |
Caspase等凋亡通路蛋白的WB检测：未活化前以酶原形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被剪切激活，可裂解相应的胞浆、胞核底物，最终导致细胞凋亡。 | WB检测方便快捷，实验结果相对直观，可进行半定量检测。 | 注意购买质量好的抗体并优化检测条件。 |
Q: Annexin V/PI双染实验的四个象限分别代表什么?
| PI | Annexin V | 代表细胞群 |
LL象限 | - | - | 正常细胞 |
LR象限 | - | + | 早期凋亡细胞 |
UR象限 | + | + | 晚期凋亡细胞或者坏事细胞
|
UL象限 | + | - | 理论上不会出现细胞；若出现有可能是操作过程中受到损害的细胞或是FACS仪器参数设置不当 |
A:根据费光情况划分四个象限(见图7.6) ,横坐标代表绿色荧光(Annexin V为FITC绿色荧光标记),纵坐标代表Pl红色荧光,四个象限分别命名为LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿过未凋亡细胞和凋亡早期细胞的细胞膜,而Annexin V可以检测到凋亡早期外翻的PS,因此四个象限代表了不同的细胞群。
图7.6流式四象限图
Q:流式上机检测细胞凋亡每次所需要的细胞量大概是多少?
A:靶细胞接种到6孔板中进行前期药物处理/转染/感染后备用。对于个体比较大的细胞,依据实际细胞密度,使用150pxt培养血培养细胞,最终进行检测需要10^5-10^6个细胞。
参考文献
1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.
2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.
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