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实验原理

细胞周期（Cell Cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能（G0期）。

流式细胞仪PI染色法检测细胞周期的原理：由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期,S 期和G2/M 期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率（如图7.7所示）

图7.7流式周期检测图说明

技术应用

检测异倍体的肿瘤细胞，检测药物、基因或蛋白等对细胞周期的影响。

实验流程

实验结果展示

图1 流式细胞周期检测图

TROUBLESHOOTING

常见问题FAQ

Q :流式上机检测细胞周期所需要的细胞量大概是多少？

A :周期检测一般采用6孔板进行实验,每孔细胞量在10的6次方左右。如果进行周期预实验,则检测所需要的时间点较多,一般每隔12小时,需要取6个时间点,每个时间点都需要留细胞样待测。需要的细胞量较大,务必通过细胞扩增得到所需实验的细胞量。

Q :周期检测前对细胞同步化处理的目的和方法是?

A :由于群体中各个细胞处于不同的细胞周期时相之中,为了研究某一时相细胞的增殖、凋亡或基因表达,需要使细胞处于细胞周期的同一时相,这就是细胞同步化技术。同步化通常有两种方式,血清饥饿法和药物阻断法。采用血清饥饿法可得到GO期细胞,可采用0.5%-1%小牛血清的培养基培养细胞48-72 h。采用药物阻断法效率高,是目前最主要的细胞同步化方法。对于倍增时间低于30h的细胞,可采用胸腺嘧啶核苷(TdR )双阻断法同步化,即连续2次处理靶细胞各24h,可以将99%细胞阻滞在GO/G1和S期。

Q :流式细胞仪PI染色法检测细胞周期前,细胞需做哪些处理?

A :细胞内的DNA和RNA都可以和PI结合,实验前需用RNase将RNA消化后进行检测;由于PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备时,必须先用终浓度70%乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。

Q :除流式细胞仪PI染色法外,周期检测还有哪些常见的方法?

A :细胞周期的流式细胞仪PI染色法可精确定量周期不同阶段的细胞比例,且方法操作简便。其他可以检测周期的方法还有1) Brdu (5-溴尿嘧啶脱氧核苷) 渗入法: BrdU是胸苷的一种类似物,加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料,采用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测,可定量研究进入S期的细胞比例。2)应用单克隆抗体识别细胞周期蛋白并结合DNA含量分析细胞周期:如在G1期早期cyclin D1表达处于峰值, cyclin E峰值出现在G1/S, cyclin A对应G2M期, cyclin B1则可标示G2/M晚期。此方法要注意周期蛋白与各细胞周期的对应关系在不同种类的纳胞中并非都遵循。

参考文献

1. David Morgan.The Cell Cycle: Prnciples of Contrl [M]. New Science Pres 2006.

2. Teres S. Hawley.Robert G. Hawley Flow Cytometry Protocol[M] Humana Press.2004.