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原位杂交（ISH）

In situ hybridization

实验原理

将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。

RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体 (Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

原位杂交实验步骤：前期胚胎的制备。

原位杂交第一天进行重新水化和固定、预杂交、杂交。

原位杂交第二天进行 1 将探针回收，放于－20C保存（通常探针可重复使用十次左右）2加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。3置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。4置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。5用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。6室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。  7  按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。

原位杂交第三天进行1） 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。2） 用1ml 1mM**米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。6）4C冰箱保存。

原位杂交服务内容

1. 细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究；

2. 感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类**状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测；

3. 癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；

4. 基因在染色体上的定位；

5. 检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；

6. 分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。

   
   

实验结果展示