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siRNA的细胞转染及筛选

Cell transfection and screening

实验原理

继植物中发现基因沉默现象后，动物细胞中的双链RNA诱导的基因沉默现象也被阐明，并于2006年获得诺贝尔医学奖的肯定，足以说明RNAi技术在医学领域即将发挥的开创性作用。siRNA（Small interfering RNA)是21-25核苷酸的小分子RNA，由Dicer酶加工双链RNA而成。siRNA与体内多种酶类结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），从而激发与之互补的目标mRNA的降解。天然的RNAi现象存在于包括人类在内的动植物体内，在调节基因表达和预防病毒感染方面起到重要作用。

技术应用

基因功能的体内外研究

RNAi类药物研发

实验流程

实验结果展示

   图1 相对定量 PCR 检测 3 组 siRNA 转染组相对阴性对照组目的基因的干扰效果

TROUBLESHOOTING

常见问题FAQ

Q：化学合成siRNA的结构？

A：化学合成的siRNA为正义链和反义链双链结构，正义链与靶序列相同，通常为19个核苷酸。另外正义链和反义链的3‘端均含有dTd的悬垂，脱氧核糖核苷可保护siRNA免受降解。客户未有验证靶点的情况下建议一次合成3对以上的siRNA进行筛选工作。

Q ：化学合成的siRNA有哪些可选种类？特点有哪些？

Q：细胞转染实验的siRNA推荐浓度是多少？

A：细胞转染实验的终浓度建议采用50-100NM，浓度过高导致细胞毒性。对于21bp的siRNAoligo，有如下简单关系：20D=6.0nmol=80ug。一般购买20D包装的siRNA，可采用DEPC水配成母液后使用前稀释。

Q：实验中采用阴性对照和阳性对照siRNA的目的？

A：由于高浓度的siRNA有可能导致非常异性的干扰结果，因此必须设置阴性对照，建议使用通过的带有荧光标记的阴性对照siRNA；将靶序列打乱之后的阴性对照siRNA，未经验证，有可能引起off-target现象。阳性对照可以确保实验中的操作无误，如转染操作，RNA抽提方法以及qPCR检测结果都是可信的。

Q：化学合成的siRNA靶点序列将来可否用于构建shRNA质粒载体和病毒包装？

A：已确认干扰效果的siRNA靶点可以进行shRNA质粒载体的构建个病毒包装工作，但毕竟表达体系不同可能存在一定的风险，干扰效果会有一定的差异。建议构建好shRNA质粒载体后进行干扰效果的验证工作。

参考文献

1.Paul CP, Good PD Winer l Effectie expression of small interfering R NA in human cells. Nature Biotechnology2002,20(5):505-508.

2.Ladunga I. More complete gene silencing by fewer siR NAs: transparent optimized design and biophysical signatuse. Nucleic Res 2007,35(2):433-440.