锐赛生物集团

自从Waston和Crick发现DNA双螺旋后，生命科学已经从形态描述的阶段发展到基因功能研究的阶段。对基因功能的研究主要集中在基因的表达，基因的突变，所表达蛋白的定位以及不同蛋白之间的相互作用对细胞功能的影响。这些研究所依赖的一个很核心的研究工具就是在细胞中通过过表达外源基因去影响内源基因的功能或者去观察基因突变的功能以及蛋白的定位对细胞功能的变化。

在细胞中过表达外源基因的研究方法主要可以分为以下2种类型：

1、过表达野生型基因：主要通过模拟内源基因的表达上调来观察目的基因功能。这是历史上使用最为广泛的一种研究手段。因为过去研究人员认为许多细胞的基本功能(细胞增值，分裂，凋亡和分化等)主要是因为基因的差异性表达导致的。通过过表达外源野生型目的基因，可以帮助研究人员了解基因的差异性表达如何影响细胞功能。在此基础上，依据基因本身的不同特性(高表达产生细胞毒性或者抑制细胞生长)，基因表达的时空特异性，人们开发出了一系列可以特异地在时间和空间上启动基因表达的诱导表达系统和组织特异性表达系统。通过融合不同的标签蛋白，还可以帮助科学家们研究蛋白的亚细胞定位，细胞或组织定位，蛋白的相互作用网络。

2、过表达显性失活(dominant negative)突变或者持续激活 (constitutively active) 突变基因从而达到失活或者激活内源基因的目的 ：有一类突变的蛋白质具有显性阻断完整的野生型蛋白质功能的能力，这常常是通过在突变型和野生型之间形成无功能的二聚体或去除限制性辅助因子的作用来实现的，因此过表达此类突变基因可以阻断细胞内内源基因的正常功能。显性失活突变型常在癌症生物学中出现。 有些目的蛋白的活性需要特殊调节，高表达并不能激活此类蛋白。可以对这一类蛋白质进行突变改造使其具有持续的活性并不受内源野生型基因的干扰，过表达此类突变基因可以模拟目的基因的持续激活功能。

过表达系统在历史上对科学家们的帮助巨大，但由于其并不能完全模拟体内基因表达的特征，甚至在很多情况下，例如没有考虑时空特异性表达因素，引入了过多的人为因素(atificial factors)导致一个错误的结论。所以现在更倾向在以下几个方面进行改进：1), 使用病毒载体，从而在降低外源基因细胞内拷贝数的情况下仍然不影响基因传递效率。 2), 使用稳定表达系统，以排除在一段时间周期内瞬时表达导致的表达量变化对基因功能研究的影响。3),  使用可控的过表达系统进行基因表达，从而更加真实模拟内源基因表达特征。

You never know how strong you are！  You never know what you're gonna get！

锐赛致力于通过发展独特、新颖的病毒包装技术为科学研究提供理解基因组和蛋白质组功能的工具。我们的使命是在转化医学的研究路上，为在全基因组水平系统地理解细胞调控机制和药物开发，提供病毒载体介导的基因导入技术，并一直努力将最好的病毒载体制备技术呈献给科学研究和药物开发工作者们。

Hotline：021-6419 7338   内容：基因-载体-病毒-稳转-细胞-整体课题

活动时间：2015/7/20~2015/7/24     2015/7/27~2015/7/31

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通过表二，可以发现病毒载体介导的基因传导方法相比非病毒载体，具备高效，广谱，长期稳定表达以及能用于动物体内细胞等几乎所有优点。

表二：不同基因传递方法的比较

虽然病毒载体介导的基因传递方法具有无与伦比的优势，可以将遗传物质导入几乎所有细胞，甚至是动物体内，然而对于广大研究人员的挑战在于，制备病毒并不是件容易的事。不同的病毒载体制备方法，关键因素都不尽相同。而且，即使许多研究人员可以在实验室制备出病毒，但这些病毒需要达到一定的滴度才能进入侵染细胞。同时，细胞越难侵染，需要的滴度就越高，而制备高滴度的病毒载体在技术和获得高滴度的稳定性两个方面都面临挑战。

锐赛成功地将多年的分子生物学和病毒研究经验结合并运用于重组腺病毒(Adenovirus)，腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)，慢病毒(Lentivirus)，逆转录病毒(Retrovirus),狂犬病病毒(Rabies virus)和杆状病毒(Baculovirus)的制备。锐赛拥有制备全世界滴度最高的六大病毒包装技术，能稳定地制备出高质量地病毒载体，并确保可以高效地用于感染体外细胞和动物体内注射。

一般来说，病毒一旦结合受体，会通过笼形蛋白(calthrin)介导的内吞进入细胞并经由胞内体(endosome)向细胞核运输。

腺病毒作为一种外染色体(epichromosomal)病毒，并不整合入基因组中，它们只是利用宿主细胞蛋白和病毒蛋白去启动病毒基因组的转录表达，并包装形成病毒颗粒。腺相关病毒，逆转录病毒包括慢病毒则会将其病毒基因组整合到宿主细胞基因组中，形成稳定表达。野生型腺相关病毒与其它哺乳动物病毒不同之处在于其可以通过Rep蛋白将病毒基因组整合到19号染色体的特定位置，而缺乏Rep基因的重组腺相关病毒载体其整合效率则大大降低，即使发生整合，也是半随机整合。逆转录病毒包括慢病毒通过病毒编码的整合酶将其基因组半随机整合(semi-random)到宿主细胞基因组。之所以称为半随机整合，是因为研究发现，逆转录病毒的整合并非完全随机，其具备一定的染色体位置偏向性，而其不同种类的逆转录病毒其整合偏向性不尽相同。慢病毒倾向于整合到转录激活区的5’端，而常用的逆转录病毒载体MLV则倾向于整合到转录起始点附近。

病毒包装需要将病毒基因组包装入病毒中，在结束一个完整的病毒组装后，病毒通过出芽方式(慢病毒)或者裂解细胞的方式退出宿主细胞，并去感染另外一个细胞。

腺病毒：腺病毒基因组非常大，而且酶切位点非常少，导致很难直接制备腺病毒载体。通常通过使用穿梭载体在细菌或者包装细胞系内进行重组从而将外源片段转移到病毒基因组中。

慢病毒：外源插入片段一旦被克隆至慢病毒载体后，其两侧为长片段重复序列(LTR)以及Y包装信号。辅助质粒主要表达用来帮助病毒包装的蛋白(gag, pol, and rev)。

腺相关病毒：腺相关病毒载体含有反向末端重复序列(ITR)。辅助质粒用来表达病毒包装必须基因(E2A, E4 VA and E1)。

小窍门：

1，构建分子病毒载体时，使用recA-细菌扩增病毒分子载体。当转染包装细胞时，尽可能使用传代次数低的细胞。

2，用病毒去感染细胞时，加入polybrene会增加感染效率

3，将病毒冻存在-80°C。但尽量减少冻融次数，推荐分装成单次使用量的小容量包装。避免反复冻融3次以上。

注意事项：

1，插入片段大小和插入片段性质因素：一些插入片段的表达由于对宿主或者包装细胞系有毒性从而使得滴度比较低。在这种情况下，使用诱导表达系统。还有一些插入片段太大或者太小都可能导致病毒包装效率不高。 添加辅助序列增加插入片段的大小或者对病毒进行浓缩纯化提高滴度。插入片段如果过大可以选择容量更大的病毒包装系统。

2，使用纯度尽可能高的质粒，最理想的是经过氯化铯密度梯度离心纯化的质粒。收获病毒后，推荐进行病毒浓缩并使用病毒纯化试剂盒或者氯化铯密度梯度离心纯化。

科学家们针对病毒载体进行了一系列改造，包括限制病毒的复制，增加病毒的侵染范围，增加病毒载体的外源插入片段的容量。比如删除了腺病毒A5载体中的E1和E3基因。E3基因对病毒包装来说是非必须基因，删除E3可以增加增加外源插入片段的容量。 去除E1导致腺病毒不能复制，从而增加其安全性。针对逆转录病毒，慢病毒和腺相关病毒的改造也是从限制复制和增加插入片段容量两个方面进行。同时，在最新一代的慢病毒载体中，研究人员还去除了3’LTR的增强子部分从而使得其整合到基因组后不会激活下游基因，更增加了安全性。辅助质粒上的序列也经过改造以降低重组的发生(无论是与病毒载体还是与宿主基因组序列)，并因此阻碍致病性病毒的产生。

如果某一个病毒载体的细胞侵染谱系不够广，则可以通过使用不同的表面糖蛋白从而增加其宿主侵染范围。其它的还包括针对多克隆位点的改造方便载体构建，改造polyA和启动子序列等。

安全性

尽管是经过多轮改造，但由于病毒的病原性特点，操作病毒载体时需要严格遵守相关规则。

表一：六大病毒载体技术的比较

磷酸钙法

1973年由Graham和Van der Eb发明并成为当今使用最广泛的化学转染方法。这种方法利用磷酸钙-DNA沉淀颗粒小，不溶解，可以被吸附到细胞表面并通过内吞进入细胞的特性将DNA运输到细胞内。整个过程需要DNA先与钙离子混合，然后加入磷酸根离子形成沉淀并呈递到细胞表面。磷酸钙溶液的组成成分和磷酸钙-DNA沉淀颗粒的大小的细微差别都会影响转染效率，使得此方法重复性极差。同时这种方法几乎不能用于原代培养细胞和动物体内的转染。

对多数细胞转染效率在10%-50%之间，表达周期能持续3-5天。

阳离子脂类

由Felgner于1987年最早用来传递基因。水化后，阳离子脂类物可以形成脂质体。当与DNA混合后，脂质体的阳离子部分可以与DNA的磷酸骨架上的阴离子电荷结合形成DNA-脂质体混合物。影响此类转染方法最关键的因素是阳离子的结构，其对转染效率的影响最终反应在两个重要的指标，DNA-脂质体混合物颗粒的大小和正负电荷比。此方法，由于操作方便，转染效率高，毒性小，所以使用非常广泛。但其体外高转染效率呈现高度细胞依赖性，且动物体内效果要比体外转染差很多。

阳离子聚合物

是一类高度亲水的大分子，主要是有单链，支链和球形三类。研究的比较多的是polyethyleneimine(PEI)，高度分支有机聚合物。和阳离子脂类转染试剂类似，其转染效果细胞间差异大。

由于化学转染方法存在着细胞毒性，转染效果高度依赖细胞类型以及对非分裂细胞，原代细胞和动物体内细胞难以转染的缺点，研究人员也发明许多物理方法(压力，电脉冲以及显微注射等)以克服细胞膜结构对传递DNA进细胞的阻碍。对于大部分研究，最常用的是电转。其具有易操作，转染效果细胞种类间差异性小等特点。但其对非分裂细胞，原代细胞的转染效果仍有待改进，且由于需要将细胞消化后于体外操作，使得其不适用于大部分动物体内转染要求。化学方法，物理方法和病毒介导的基因传递方法的优缺点比较如表三。

RNAi在探索基因功能中的应用：人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或shRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特 异方式沉默目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时shRNA病毒载体表达文库的构建，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。

RNAi在基因治疗领域中的应用： RNAi作为一种高效的序列特异性基因沉默技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择 在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外可通过使用 肿瘤特异性启动子如hTERT 引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。

RNAi技术在基础研究和药物开发中的优点

通过模拟自然条件下的分子作用通路起作用

无论是siRNA还是shRNA，尤其是后者，近乎是模拟细胞内在的RNAi通路发挥作用。所以，这些人工的RNA干扰实验具有细胞内在RNAi的作用特点，高效(理论上可以抑制任何基因的表达)和特异性强(通过精心设计，可以专一性抑制某个基因的表达)。

可以抑制任何基因的表达

传统的干扰基因表达的方式和药物作用方式的缺点在于其只能针对少数特定蛋白设计功能干扰实验或者开发药物。尽管如此，传统的显性失活突变或者化学小分子药物其专一性仍然面临许多问题。单抗药物虽然专一性好，但靶底蛋白局限于表面受体和分泌蛋白。因此，结合后基因组时代，发现了大量未知功能基因，无论是要了解这些基因的功能还是去针对这些蛋白开发特异性药物，RNA干扰技术更显得重要和迫切。同时，许多疾病都是由相关基因的点突变引起，设计特异针对突变基因的RNAi可以达到更佳的治疗效果。因此理论上，RNA干扰技术不仅可以抑制基因组上任何一个基因的功能，还能特异性地针对突变基因发挥干扰功能。

改变药物作用和传统基因功能研究的模式

由于RNA干扰可以抑制蛋白的表达，所以它的作用模式不同于普通药物和传统的研究基因功能的技术(抑制蛋白的功能)，其可以在蛋白发挥作用之前就达到去除的效果。

简化药物开发和基因功能研究

RNA干扰技术可以避免冗长的小分子药物开发周期和平台，同时还可以加速基因功能研究和药物靶底的发现。

siRNA(small interfering RNA)和shRNA(short hairpin RNA)

RNA干扰作用可以通过两类分子介导：化学合成的双链siRNA和载体介导的shRNA。尽管siRNA和shRNA都能达到沉默基因表达的效果，它们的作用机制和作用效果都不尽相同。

siRNA：进入细胞后，双链siRNA直接和RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，或者先结合Dicer/TRBP/PACT复合物，然后经由之介导和 RISC结合，解旋成单链， 并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导 （guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性降解。

和siRNA不同的是，在细胞核内经由shRNA表达载体转录合成，然后被处理运输到细胞质中，并最终结合RISC复合物。最初设计shRNA的表达系统时，科学家们尽量模拟细胞内源RNA干扰通路的特点，所以一般认为其作用机制更接近microRNA通路。因此对microRNA作用机制的研究可以帮助人们设计更好的shRNA表达系统，比如使用miR-30-shRNA载体。将shRNA表达载体传递入细胞内后，载体需要被运输到核内转录表达并经由Drosha /DGCR8复合物处理形成shRNA前体(pre-shRNA)。之后通过exportin 5运输至细胞质，结合Dicer/TRBP/PACT复合物并被剪切成成熟的shRNA。最后结合RISC复合物并降解目的mRNA或者通过P-bodies抑制目的基因的翻译。RISC复合物中的Agonaute因子不仅可以帮助成熟的shRNA片段结合到RISC复合物中，还能介导转录和转录后水平的基因沉默效应。Ago-2降解mRNA，含其它Ago因子的复合物不具备核酸酶降解能力，但可以结合目的mRNA的3’非翻译区的同源序列从而抑制mRNA的翻译。因此shRNA表达载体还可以通过抑制目的mRNA的翻译来达到基因沉默的效果。

Bi-functional shRNA(双功能shRNA)

第三类双功能shRNA的设计基于shRNA既可以降解mRNA又可以抑制mRNA的翻译的特点。由于这两个机制分别由核酸酶-H依赖的降解通路和互补依赖的翻译抑制通路介导，所以研究人员在一个载体中设计两类反应不同作用机制的茎环噜噗(stem loop)结构。由于双功能shRNA载体可以同时通过两类机制将shRNA招募到目的mRNA上，并且通过两种机制抑制基因表达，所以在细胞内通过传递一个双功能shRNA载体同时表达两种shRNA和siRNA相比，基因沉默效率更高，和普通的shRNA相比，基因沉默速度更快。

双功能shRNA载体由两个茎环噜噗结构组成，一个是和靶序列完全匹配的双链序列介导降解机制，另一个是在passgener strand的9-12位含有错配序列的双链结构介导翻译抑制机制。

外源导入的siRNA结合RISC复合物的能力要比shRNA低10倍，虽然将siRNA的长度增加到29-30nt可以增加结合RISC复合物的效率，但也增加了off target效应，引起更多的非专一性基因干扰。shRNA由于模拟microRNA的作用通路，所以相比siRNA其基因沉默效率更高。siRNA和shRNA的优缺点见表四。锐赛选择使用病毒载体介导的shRNA干扰，并通过构建shRNA稳定株，能最大程度的避免使用体外化学合成的siRNA所带来的一系列问题。

a: 1) 改善off target效应; 2) 提高细胞内稳定性

1.设计合成有效的RNAi干扰片段

RNAi的核心需要RNAi干扰片段对相应mRNA进行有效的结合和作用。最关键的步骤在于shRNA的序列设计。shRNA的设计可以通过检索,优先选用经过验证的序列片段或设计多对干扰序列，同时设置阴性对照（排除非特异沉默现象）和阳性对照（确认整个实验体系的有效性）。锐赛拥有独特的shRNA干扰片段设计平台。

2.选择合适的shRNA载体和传递载体

将shRNA转染入细胞是RNAi实验成败的关键。 生物使用第二代shRNAmiR30载体，其抑制目的基因表达的效率比普通shRNA载体要高一个数量级，也可以避免使用siRNA所带来的诸多问题。另外，病毒载体具备细胞侵染谱系广，基因传递效率高，制备稳定株方便等特点，使得其成为运输shRNA入细胞的一个最理想的工具。

编码microRNA的基因，许多成簇分布在基因组中，并以多顺反子形式串联在一起转录。还有一些单独表达或者编码在蛋白表达基因中。依据其在基因组中的分布，可以将microRNA分为以下2类：

1，基因间microRNA，microRNA编码基因位于蛋白编码基因之间。

2，基因内microRNA，microRNA编码基因位于蛋白编码基因内。研究发现这一类microRNA可以位于蛋白编码基因的内含子，外显子 ，3’UTR和 5’UTR 区。现有数据表明，人microRNA编码基因大部分位于基因间(42%)和蛋白编码基因的内含子区(44%)。

显然，microRNA编码基因可以独立存在或者依托于蛋白编码基因存在，因此其转录表达机制也相应被分为两类(见图X和图X)。整个过程大致可以分为5个步骤：图示基因间microRNA的生成：基因间microRNA有独立的编码基因，主要由RNA聚合酶III转录产生。

1),转录产生初始microRNA(pri-miRNA): 转录microRNA。基因间microRNA主要由RNA聚合酶II或III转录产生一个初始的长转录链，称为pri-miRNAs，在完成5’端加帽和3’添加polyA尾后，可以达到几Kb长。内含子microRNA在RNA聚合酶II转录产生mRNA后，经由RNA剪切产生初始microRNA。

2),产生microRNA前体(pre-miRNA)：内切酶剪切pri-miRNAs。RNA内切酶III(Drosha)，以及DGCR8 /Pasha负责将pri-miRNA剪切成60至100 nts长的pre-miRNAs。含有初始miRNA的内含子被称为mirtron，其从编码蛋白的初始mRNA的内含子区剪切出来

后，折叠成一个和pre-miRNAs结构非常类似的发夹结构，并随后进入miRNA加工程序。

3),将pre-miRNA从核内运输至细胞质中：这个过程主要由RanGTP和exprotin-5完成。

4),产生成熟的miRNA：内切酶剪切pre-miRNA。在细胞质中，Dicer进一步将pre-miRNA剪切成约22nt长的双链成熟miRNA。图示基因内microRNA的生成：基因内microRNA(多为内含子miRNA)经由蛋白编码基因的mRNA剪切产生，因此主要由RNA聚合酶II转录产生。

5),形成miRISC。成熟miRNA双链的结合RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。成熟的miRNA双链只有一条向导链可以进入RISC复合物，另一条链则被去除。miRISC复合物中含有Dicer，TRBP,PACT和Gemin3,然而直接和miRNA结合的是Argonaute因子，其可以介导miRNA和目的mRNA的序列匹配以导致随后的翻译抑制。人Ago2因子同时还具有核酸酶活性，所以其不仅可以参与组成miRISC复合物，还与其它蛋白形成siRISC(siRNA-induced silencing complex)复合物，负责处理外源的siRNA。

microRNA以双链形式存在，激活时呈单链形式，并且通过miRISC复合物发生作用。miRISC复合物中的单链miRNA的5’端的第2至第8nt的序列部分与目的mRNA的靶序列部分完全匹配，miRNA的这部分序列被称为种子序列(seed site)，是miRNA发挥作用的核心序列。其它序列的部分匹配有助于稳定miRNA:mRNA相互作用。其中间和3’端部分有助于形成miRISC复合物。mRNA的5’端和3’端 UTR区以及内含子区，编码区都发现有miRNA的结合位点。依据具体情况的不同，miRNA既可以抑制目的基因的翻译，也可以降解目的mRNA。

1), 完全匹配的序列的长度。匹配序列越长，越倾向于降解目的mRNA。至今发现的大部分都是部分匹配。只有种子序列的或者种子序列之外的部分匹配度不高的miRNA主要通过翻译抑制沉默基因表达。

2), 目的mRNA中miRNA识别位点的数目。数目越多，其作用机制越倾向于降解途径。

3), 识别位点的空间位阻。空间位阻决定了miRNA:mRNA序列匹配能力，因此也决定了降解和翻译抑制机制的选择。

microRNA作为细胞功能的调节因子而不是特定基因的表达调控因子：依据生物信息学预测，每个miRNA有超过1000个靶基因，而每个蛋白编码基因可以被许多不同的miRNA调节。这表明miRNA对细胞功能的影响是建立在对靶序列，而不是靶基因的调控基础之上。

microRNA的表达 : 研究人员发现，除少数miRNA呈现广谱表达之外，相当部分的miRNA的表达呈现高度的组织和细胞特异性。例如，miR-122的表达含量占据肝组织中所有miRNA的70%的部分，而miR-142和miR-143分别占据结肠和脾脏中所有miRNA的约30%的部分，心脏中，miR-1的表达量占据所有miRNA表达量的45%。miRNA在组织和细胞里的这种特异性分布，表明miRNA在调控细胞分化和组织发育中起到重要作用。更重要的是，人们发现许多miRNA的表达还呈现高度的疾病特异性，这为人们开拓了一条新的疾病治疗之路。

microRNA的突变：一般认为，生理或者病理条件下尤其是肿瘤发生中microRNA的表达调控模式与癌基因或者抑癌基因的mRNA的表达调控之间没有太大区别，比如从转录，转录后的加工，表观遗传学，基因组拷贝数的变化到突变。但至今数据表明， microRNA的突变非常罕见。有一些microRNA编码基因位于基因组的一些易重组或者脆性位点(fragile sites)，使得常发生扩增，缺失等变化。例如miR-15a和miR-16-1位于染色体13q14的位置，这个位点在脑垂体肿瘤中常发生缺失。

microRNA的单核苷酸多态性：无论是 microRNA还是其靶底mRNA序列的多态性分布都非常普遍。因为microRNA的生物学功能的发挥呈现序列高度依赖性，所以对不同细胞的microRNA和靶底mRNA序列的多态性研究可以更好地达到干扰或者过表达microRNA的效果，同时还可以有助于了解疾病的发生机制。

激活或者抑制miRNA的功能：通过过表达miRNA，敲除miRNA编码基因，表达或者化学合成miRNA反义核酸(AMO or ASO)，或者影响miRNA的成熟加工(例如影响Dicer的表达水平)，干预miRNA的稳定性等方法，可以达到在生理或者病理条件下干预miRNA的功能，以研究miRNA对细胞和机体功能的影响。

如下所示，microRNA和许多疾病的发生密切相关，而且这个范围随着研究的深入正在迅速扩大。由于microRNA表达量的增加或者降低导致其功能的激活或者失活是影响疾病发生的一个关键因素。

1)，希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果。例如在正式实验之前进行的小规模预实验。

2)，2-4天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的，比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用，或者观察某些细胞周期抑制，凋亡或细胞存活相关基因的细胞表型。

3)，细胞个体差异对实验结果有影响。体外培养非原代细胞，多为转化细胞系或者癌细胞，细胞个体差异大，瞬时转染或者使用腺病毒/腺相关病毒载体进行转导更可以反映细胞群体行为。或者使用逆转录病毒载体构建混合稳定株。

不同转染方法介导的稳定整合参数比较

为什么病毒载体是构建稳定细胞株最好的工具

化学试剂介导的转染方法和电转，整合率低，同时整合位点不稳定，易发生再次丢失的情况，而且整合位点一般都在转录活跃区之外，所以并不是理想的稳定整合工具。另外，整合后的拷贝数是由核内的外源DNA局部浓度，而不是转染时的DNA的量决定，而化学方法在输入质粒载体入核的效率比电转和病毒载体相比要低得多，导致其转染相同细胞所用质粒载体用量要大大高于其它方法，造成入核质粒载体量难以控制，这也解释了为什么化学转染方法和其它两种方法比，更倾向于得到串联多拷贝。以上种种因素，导致使用非病毒载体转染方法构建稳定株，成功率低，稳定性差，稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等缺点。

逆转录病毒载体由于整合率高，是非常理想的稳定株构建工具(表五)。而且通过控制逆转录病毒载体转导的实验条件，理论上可以确保每个细胞只有单拷贝插入。同时由于病毒载体是通过病毒重组酶将外源片段整合入染色体中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于转录活跃区段，且整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基因组中。最重要的是整合几率和所有其它化学，物理转染方法比，增加5至6个数量，使得稳定株构建不再成为实验研究的障碍。由于整合几率非常高，所以很容易获得混合稳定株。

腺病毒载体整合率和普通转染方法差异不大，被认为是不能整合的一类病毒载体，因此相关研究数据较少，不建议用来构建稳定株。非野生型腺相关病毒载体(Rep-)整合率较低，但因为野生型病毒载体可以定点将病毒基因组整合于人19号染色体，所以从安全性和稳定性角度来说，潜力都非常巨大。由于诸多因素，研究人员仍然在对其进行改造中，包括考虑到啮齿类动物不含有人19号染色体对应的整合位点序列。

主要有三类方法：

1)，单克隆环法：此类方法多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株的实验。其优点在于工作量小，只需将转染或者病毒载体感染后的细胞按照一定的细胞密度转移至新皿中，并使用合适的药物进行筛选，最后在克隆环的帮助下对单克隆细胞株进行挑选，并在新皿中完成扩增。缺点在于需要对细胞密度和药物浓度绘制致死曲线并选取合适的细胞密度和药物浓度进行筛选，一些细小的密度和浓度差别都会导致难以获取均一的单克隆，结果导致获取的克隆不纯，含有非整合的细胞。稳定整合的细胞在这样一类混合细胞中，很快会失去生长优势，最终导致失去稳定株。

2)，96孔单克隆稀释法：此类方法同样多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株以及筛选悬浮细胞稳定株的实验。其优点在于，理论上可以得到非常均一的单克隆，同时可以筛选悬浮细胞稳定株。其缺点在于，工作量比较大。

3)，逆转录病毒混合克隆制备法：此类方法适用于需要制备混合稳定株。优点在于可以在短时间内(1周)获得稳定细胞株，同时也可以随时将细胞稀释转移至新皿中获得单克隆细胞株。缺点在于需要制备逆转录病毒载体。锐赛的研究人员开发出快速制备病毒并获得稳定细胞株的技术，帮助科学家们迅速获得稳定株。