锐赛生物集团

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基因功能学研究
基因功能组研究1


锐赛生物为基因功能研究提供全面、高效和严谨的载体设计与构建服务。


我们在现有的慢病毒、腺相关病毒、腺病毒和逆转录病毒载体基础上提供基因表达载体构建以及定点突变、用于基因沉默的shRNA设计与构建、MicroRNA表达与封闭载体设计与构建、荧光素酶报告基因系统载体构建（启动子、UTR以及其他功能序列）以及Cre, TALEN和Cas9基因组编辑工具载体设计与构建。

AAV构建及包装

腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV，(2)rAAV的低产出，(3)生成有复制能力的AAV。在此我们描述了新的辅助质粒(pH3和pH5)，排除了Ad共转染的需求。辅助质粒表达AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。当辅助质粒在没有Ad感染的情况下共转染到人293细胞中，rAAV载体产量超过了pAAV/Ad包装质粒的80倍。另外，有复制能力的AAV在rAAV制备过程中少于0.00125%。此系统的主要优点是(1)无需感染性的腺病毒(2)只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。我们相信该双质粒转染系统因其简便性和高产出而使AAV载体系统能被更广泛地使用。该系统尤其将对多rAAV载体的临床前分析有用。

案例展示
案例一
案例二
案例三
案例四
案例五
案例六
案例七
案例八
案例九
案例十
案例十一
案例十二
案例一


案例一　 AAV介导shRNA定位注射在外侧缰核



利用RNA干扰特异性地在外侧缰核降低βCaMKII分子的表达可以逆转天生抑郁大鼠模型的抑郁行为表型
Li K, et al Science 30 August 2013: Vol. 341 no. 6149 pp. 1016-1020  DOI: 10.1126/science.1240729
案例二


案例二  rAAV局部注射大脑皮层基因敲减实验


Cao et al. Nature Medicine, published online 5 May 2013; doi:10.1038/nm.3162

案例三


案例三  rAAV玻璃体腔注射表达光遗传工具

Zhang et al. Proc. of SPIE , 2013. July, Vol. 8548 854842-1
案例四

案例四




Ht,heart; Di, diaphragm; Qu, quadriceps; So, soleus; ED, extensor digitorum longus; TA, tibialis anterior





实验结果：AAV2/9型对心肌感染能力最强，成年鼠的骨骼肌易感性比幼鼠更强。利用AAV转导GAA（酸性葡糖苷酶）到缺陷型小鼠，ECG检查发现PR缩短。

Pacak et al. Circulation Research.2006

案例五

案例五

实验方法：使用AAV-HGFK1（Myc抑制）和Ad-p53混合尾静脉注射大肠癌模型鼠。

实验结果：脾和肝脏的质量经病毒注射的组别明显变小。TUNEL法检测发现癌细胞中凋亡细胞数明显增加。





C.M. Lin et al. Mol Cancer Ther 2008

案例六

案例六

实验方法：将AAVCTLA4Ig（T cell激活抑制）经肾动脉注射于冷冻的异源移植器官。将AAVLacZ注射于同源移植器官。之后进行移植手术。

实验结果：移植后90天，仍可观察到LacZ表达，且表达集中于近端肾小管上皮细胞。转化TLA4Ig基因的异源移植器官的生理功能显著得到恢复，与单纯移植相比有显著改善；经转化的器官所引起的免疫反应也远小于未转化组。


Giuseppe Remuzzi. J Am Soc Nephrol. 2006

案例七

案例七

实验结果：表明AAV9对小鼠角膜基质的感染效率是最高的。TUNEL法和F4/80，CD11b染色检测表明AAV感染并没有引起明显的免疫反应。


Rajiv R. Mohan et al. Exp Eye Res 2011

案例八

案例八　腺相关病毒感染RGC进行基因干扰实验研究

Neurochemical research, 2013, 38(7): 1365-1374.

案例九


案例九　腺相关病毒感染心肌细胞进行基因表达研究







Journal of Biological Chemistry , 287(53), 44464-44470.


案例十


案例十　rAAV定位注射脑缰核区域进行基因沉默


Science, 341(6149), 1016-1020.

案例十一


案例十一　rAAV定位注射脑PVN区域进行基因表达


Zheng J J, Li S J, Zhang X D, et al. Oxytocin mediates early experience-dependent cross-modal plasticity in the sensory cortices[J]. Nature neuroscience, 2014

案例十二

案例十二　不同血清型rAAV整体注射小鼠后器官感染强度比较，每只小鼠的注射病毒量为 1011 v.g.



Molecular Therapy vol. 16 no. 6, 1073–1080 june 2008;



技术详情
技术服务
售前常见问题
技术详情

一、腺相关病毒（AAV）载体二、腺相关病毒（AAV）干扰载体
●广泛用于体内实验研究（定点注射与整体注射）●广泛用于体内实验研究（定点注射与整体注射）
●表达稳定高效；非整合，转基因安全性高●表达稳定高效；非整合，转基因安全性高
●CMV, EF1a, CAG，GBG, Syn 等启动子可选●构建快捷，序列保证准确
●EGFP、mCherry等荧光蛋白可选●标记基因可采用EF1a或GBG启动子表达，稳定高效

三、腺相关病毒包装与纯化
●腺相关病毒包装采用三质粒系统进行包装，共转染后通过对细胞裂解物进行密度梯度离心纯化和收集病毒。

四、腺相关病毒滴度检测五、腺相关病毒感染细胞
●检测方法：定量PCR检测病毒基因组中的外源DNA拷贝数●对于特定细胞有较高的感染率，如心肌和血管内皮细胞
●实验原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA●感染温和，表达稳定长效


六、腺相关病毒定位注射


●感染范围广，可以用于神经系统、眼睛、心肌、肝脏、肌肉和肺部定位注射或定向给药

●滴度高，颗粒小，扩散能力强

●表达稳定，可持续半年以上

●外源基因定向重组，免疫原性低，极少发生非特异反应和免疫抑制，适合于进行基因治疗研究



rAAV定位注射脑皮层区域进行基因沉默

Nature medicine, 2013, 19(6): 773-777.


七、中枢神经AAV注射

rAAV定位注射纹状体进行基因沉默

PloS one, 2013, 8(6): e64637.

立体定位注射 12 周龄SD 雄性大鼠实验前麻醉。注射时， 将27 号针头用26 号内径的塑料管和10μl 汉米尔顿注射器（由微量注射泵推动）连接在一起，每分钟注入病毒0.2μl，每次3μl。定位海马的坐标是前囟后3.6mm，侧向2.0mm，背向2.8mm。每当针头定位后或是准备拔出前都停留1min。

八、视网膜下AAV 注射

小鼠用3%异氟醚麻醉，用30 号注射针在接近晶状体的巩膜上切开一个小口，通过这个小孔，用5μl 汉密尔顿注射器（连接微量进样装置）将2μl AAV 病毒缓慢（20-30s内）注入视网膜下。动物选择P21以后的小鼠。从病毒注射到后期实验中间至少休息3个星期。需要进行行为学实验的，两只眼睛都要感染相同的病毒。











九、整体注射

整体注射是最接近临床治疗方式的实验方法。一般地，利用病毒进行整体注射主要通过胚胎注射、肌肉注射和静脉注射等方式。实验研究发现，对于大部分病毒而言，在动物的肝脏、肾脏和胰脏积累较多；或者通过缺血再灌注等方式，也可以实现心脏的病毒感染。而rAAV病毒作为一种细小病毒，颗粒小，免疫原性低，已经广泛用于整体实验并获得了积极的效果，成为整体实验研究中日趋突出的病毒工具。

病毒的整体注射对病毒滴度和体积有较为严格的要求，滴度低的病毒会造成感染和表达减弱甚至根本无法感染；滴度过高或杂质过多的病毒会引起免疫反应造成动物死亡。作为免疫原性最低的AAV病毒载体，其在不同组织中的感染活性与血清型有着密切关系。其滴度范围一般在1012v.g./ml以上。一般认为，为了增强在某一组织中的表达，采用组织特异启动子可以达到更好的效果。

rAAV整体注射肝脏感染效果

技术服务

病毒载体比较


售前常见问题

1、病毒滴度检测（质控）

qPCR检测基因组拷贝数（genome copy），也可以根据客户要求附加VP蛋白检测（费用和周期加）


2、病毒滴度保证范围

小包>5x10E11 v.g./ml;中包> 5x10E 12v.g./ml；大包>1x10E13 v.g./ml


3、启动子选择

神经组织：

广泛表达（CAG, CBG,EF1a,CMV);

特异表达

Syn 神经元

CamKII锥体神经元+,

GFAP 星形胶质细胞+，小胶-，少突-

眼睛：CAG；肺：CAG,CMV；心肌：CMV


4、滴度选择

定位注射： 1x10E12 v.g./ml以上

整体注射：1x10E13 v.g./ml以上（必须纯化）

体外感染：10E11 v.g./ml以上


5、血清型选择问题

神经系统（AAV9，AAV8，AAV5，AAV2，AAVDJ）

眼科（AAV2）

肺（AAV5）

心肌（AAV9）

体外细胞感染（AAV2）


6、光遗传相关问题

DIO，Flex，都是Cre依赖的

光遗传蛋白需要上膜才能起作用（启动子选择问题）

提供试用装


7、腺相关病毒干扰

需要有效靶点（外筛）

锐赛生物-AAV技术介绍.pdf
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